Συγκριτική ανάλυση του μεταβολικού προφίλ φύλλων αμπελιού (Vitis vinifera) που παρουσιάζουν διμορφισμό μετά την προσβολή του βλαστού από έντομο

Abstract

Τα φυτά κατά την ανάπτυξή τους καλούνται να αντιμετωπίσουν διάφορες βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις είτε σε επίπεδο φυτού αρχικά, είτε σε επίπεδο καλλιέργειας. Οι καταπονήσεις επιδρούν αρνητικά στην φυσιολογία των φυτών και στην ανάπτυξή τους και κατ’ επέκταση στη γεωργική παραγωγή και στην ποιότητα των παραγόμενων προϊόντων. Έχει υπολογιστεί ότι σε συνθήκες αγρού οι αποκλίσεις από τις ιδανικές συνθήκες ανάπτυξης έχουν ως αποτέλεσμα το καθαρό προϊόν να αντιπροσωπεύει μόνο το 20-30 % αυτού που μπορεί εν δυνάμει να παραχθεί από τα φυτά. Οι απαιτήσεις της αγοράς για προϊόντα υψηλής διατροφικής αξίας και ποιότητας, δημιουργούν την ανάγκη για την περαιτέρω διερεύνηση της επίδρασής τους των καταπονήσεων στην μοριακή φυσιολογία των φυτών σε ένα πρώτο επίπεδο και σε ένα δεύτερο επίπεδο σε σχέση με την αγροτική παραγωγή. Οι νέες τεχνολογίες βιομοριακής ανάλυσης υψηλής απόδοσης (ή ομικές) μπορούν να προσφέρουν ολιστική και αξιόπιστη εικόνα της μοριακής φυσιολογίας των φυτών. Πιο συγκεκριμένα προτείνεται η μεταβολομική ανάλυση ως εργαλείο (α) μελέτης της in vivo φυσιολογίας των φυτών σε δεδομένο χρόνο και υπό δεδομένες συνθήκες και (β) παρακολούθησης αγροτικών καλλιέργειών. Η μεταβολομική αποτελεί μια ολιστική αναλυτική προσέγγιση του μεταβολισμού, παρέχοντας το μεταβολικό του «αποτύπωμα» και γεφυρώνοντας την απόσταση μεταξύ γονοτύπου και φαινοτύπου. Μέσω της μεταβολομικής δίνεται η δυνατότητα της μελέτης της in vivo φυσιολογίας ενός οργανισμού σε δεδομένο χρόνο και υπό δεδομένες συνθήκες και ο προσδιορισμός συγκέντρωση πολλών μικρών ελεύθερων οργανικών μορίων (μεταβολίτες) οι οποίοι αποτελούν τα αντιδρώντα και τα προϊόντα των μεταβολικών αντιδράσεων, παρέχοντάς το πλήρες μεταβολικό αποτύπωμα του οργανισμού. Το αμπέλι αποτελεί ένα από τα μεγαλύτερης οικονομικής σημασίας φυτά παγκοσμίως και για την παραγωγή του σταφυλιού αλλά κυρίως για την παραγωγή οίνων, και ιδιαίτερα οίνων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Οι καλλιέργειες αμπελιού, προσβάλλονται από διάφορα παθογόνα και εχθρούς, που σε αυτά συμπεριλαμβάνονται και ένας σημαντικός αριθμός εντόμων και ιών. Παρά το ευρύ φάσμα των εντόμων και των ιών που προσβάλλουν το αμπέλι, η γνώση γύρω από την επίδραση τους σε μοριακό επίπεδο στην ποιότητα των σταφυλιών και του κρασιού παραμένει περιορισμένη. Σκοπός της παρούσας πτυχιακής εργασίας είναι η συγκριτική μελέτη του μεταβολικού προφίλ φύλλων αμπέλου που παρουσιάζουν διμορφισμό μετά την προσβολή του βλαστού από έντομο. Στο πλαίσιο αυτό για την ολιστική ανάλυση του μεταβολισμού των φύλλων και τη μελέτη της επίδρασης της προσβολής, χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία υψηλής απόδοσης της μεταβολομικής με χρήση Χρωματογράφου Αερίων- Φασματόμετρου Μάζας (GC-MS). Με την ανάκτηση του μεταβολικού προτύπου ανιχνεύονται ποιοτικές και ποσοτικές αλλαγές στο μεταβολικό προφίλ που οφείλονται στην προσβολή του βλαστού από έντομο. Συγκεκριμένα στην παρούσα πτυχιακή χρησιμοποιήθηκαν βλαστοί προσβεβλημένοι στους οποίους υπήρχαν φύλλα που παρουσίαζαν διμορφισμό και χωρίστηκαν σε φύλλα μάρτυρες και φύλλα προσβεβλημένα (ανάλογα με τη θέση στο σημείο προσβολής). Αναλύθηκαν τρία φύλλα από κάθε κατάσταση φυσιολογίας και τελικά ανακτήθηκαν 18 χρωματογραφήματα. Μετά την κανονικοποίηση και το φιλτράρισμα των δεδομένων καταλήξαμε στις σχετικές συγκεντρώσεις 54 μεταβολιτών. Στη συνέχεια για την εύρεση των μεταβολιτών που διαφοροποιούνται σημαντικά μεταξύ των διαφορετικών καταστάσεων φυσιολογίας και συμβάλλουν στον διαχωρισμό των προτύπων, υπολογίζεται ο λόγος αλλαγής (fold change). Ο λόγος αλλαγής υπολογίζεται απλά ως ο λόγος των σχετικών επιφανειών κορυφής κάθε μεταβολίτη μεταξύ δύο καταστάσεων (προσβεβλημένα/μάρτυρες). Στα προσβεβλημένα φύλλα αρκετά μόρια παρουσιάζουν μικρότερες σχετικές συγκεντρώσεις σε σχέση με τα φύλλα μάρτυρες ενώ αυξάνονται δύο μόρια που ίσως σχετίζονται με την κινητοποίηση του αμύλου στα προσβεβλημένα φύλλα. Το πολυσυλλεκτικό αυτό μεταβολικό προφίλ, καθώς και οι επιμέρους αλλαγές στους μεταβολίτες, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ευαίσθητος βιοδείκτης μιας διαταραχής ή καταπόνησης. Συμπερασματικά η Μεταβολομική καθώς και οι ολιστικές προσεγγίσεις της Συστημικής Βιολογίας μπορούν να βελτιώσουν δραστικά τις μεθόδους και τεχνικές παρακολούθησης της μοριακής φυσιολογίας των φυτών, της απόκρισης των φυτών στις καταπονήσεις της καλλιέργειας και του αγροτικού προϊόντος.